IAP B聚体的各亚基克隆及表达的初步研究
本研究用含有去纤维绵羊血的B-G培养基活化百日咳杆菌后，用改良的S-S液体培养基成功培养出不含其它培养基成分污染的百日咳杆菌。通过比较小批量细菌DNA提取法与CTAB法提取法发现，CTAB法提取的基因组DNA具有纯度高、片段大的优点。 在对IAPB聚体蛋白性质的进行初步分析后，选择了以GST融合的方式试验可溶性表达它的四个亚基(S2，S3，S4和S5)。通过比对已报道的四个典型株(152us，TohamaI，ptxslD，ptxstrain18323)的基因序列的一致性，设计了四对分别带有BamHI与XhoI酶切位点的引物。采用套式PCR解决了S2与S3基因同源性的影响，并特异性地扩增出了S2与S3的序列。S4、S5基因则由直接扩增产生。用凝胶回收试剂盒纯化PCR产物后，将酶切片段连接到表达载体pGEX-6p-1上，并通过测序证实克隆的序列与已经报道的TohamaI完全一致，完成了IAPB聚体四个亚基的表达载体的构建工作。 将构建的表达质粒转化E.coliBL21(DE3)后，分别试验了诱导温度在14，20，25℃表达S2，S3亚基的情况，发现在20℃、25℃诱导时，表达的融合蛋白主要呈现不溶状态；而在14℃诱导时，S2，S3的GST融合蛋白可溶部分高，最终纯化的产物经SDS-PAGE分析显示与理论大小一致，每升培养液可得S2亚基0.4mg、S3亚基0.6mg；S4、S5表达量低，有待于进一步研究。
- 作者：
- 潘煦文
- 学位授予单位：
- 新疆农业大学
- 专业名称：
- 生物化学与分子生物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2006年
- 导师姓名：
- 雒秋江
- 中图分类号：
- Q786
- 关键词：
- IAP；基因克隆；蛋白表达；百日咳杆菌
- IAP；gene clone；protein expression